卵泡是卵巢的基本结构组成和功能单位，卵泡排出健康成熟的卵子依赖于卵泡的正常发育。卵泡闭锁是指卵泡在多种生理或病理因素刺激下退出正常生理发育轨迹的现象。正常情况下，卵泡闭锁有助于维持卵巢内环境的稳定，然而，由于规模猪场逐渐成为我国主要的生猪养殖方式，母猪饲养密度过大、频繁转群及其他环境因素等极易引起母猪应激，导致性腺轴功能紊乱，引发卵泡异常闭锁，不仅影响了母猪繁殖性能，而且降低猪场经济效益。
目前，虽然对猪闭锁卵泡的形态学特征、发生时期和生化特征已经比较明确，但对于闭锁卵泡基因整体表达情况了解较少。颗粒细胞作为卵泡重要的组成部分，通过合成分泌类固醇激素等在卵泡闭锁中发挥关键作用。利用高通量测序技术全面揭示闭锁卵泡颗粒细胞基因表达，有助于解析卵泡闭锁发生机制。本研究基于卵泡的形态特征，分别收取健康卵泡和闭锁卵泡的颗粒细胞进行转录组测序，对两者差异表达基因参与的生理学过程进行分析，探究母猪卵泡闭锁的机理，并为提高母猪的繁殖力提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
在某屠宰场收集卵巢后，放置于37℃含有1%青霉素-链霉素的PBS缓冲液中送至实验室备用。
1.2健康卵泡和闭锁卵泡的形态学鉴定
根据文献资料及形态学特征鉴定并挑选出健康卵泡和闭锁卵泡用于进一步研究。
1.3猪卵泡颗粒细胞的获取
卵巢达到实验室后，使用生理盐水清洗3遍。随后使用10 mL注射器抽吸卵泡液，卵泡液放置于10 mL无菌离心管中，1 000 rpm离心5 min，去掉上清液，使用M199培养液重悬细胞，重复2～3遍，最后将重悬细胞倒置于10 cm培养皿内，选取片状颗粒细胞，收集到Trizol裂解液中。
1.4 RNA提取及cDNA合成
使用Trizol提取颗粒细胞的总RNA。使用NanoDrop核酸检测仪器测定RNA浓度和纯度，合格样品的OD260/OD280在1.8～2.1。
使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR反转录试剂盒合成cDNA。置于PCR仪中，50℃15 min→85℃5 s。产物保存-20℃备用。
1.5 qPCR检测
使用Light-Cycler®480 SYBR Green I Master Kit在LightCycler 480仪器上进行基因水平进行检测。获得基因表达cT值后使用2-∆∆CT方法对基因表达水平进行相对定量。
1.6转录组测序分析
使用Trizol提取颗粒细胞的总RNA后加入PolyA和接头后使用Hiseq 4000平台进行文库测序。每组设置3个生物学重复。参考基因组选择Sus_scrofa10.2，序列比对软件选择HISAT2，最终使用featureCounts软件和DESeq2筛选差异表达基因。使用clusterProfiler对差异表达基因进行富集分析。
1.7数据处理和分析
采用2-△△Ct法对定量PCR结果进行分析，数据采用平均值±标准差表示，每个样品的每个基因进行3个重复孔检测。
2结果与分析
2.1猪健康卵泡和闭锁卵泡的鉴定和选择
健康卵泡的卵泡液清亮、表面血管丰富、结构清晰。闭锁卵泡的卵泡液浑浊、表明没有血管分布，结构不清晰（图1A）。进一步观察来源于健康卵泡和闭锁卵泡的卵丘卵母细胞复合体形态和颜色对鉴定结果进行确认。来源于闭锁卵泡的卵丘卵母细胞复合体形态扩散，不紧密，且颜色偏黑（图1B）。
猪健康卵泡和闭锁卵泡
图1猪健康卵泡和闭锁卵泡
A.猪卵巢：▲为闭锁卵泡，*为健康卵泡；B.猪卵丘卵母细胞复合体：▲为源于闭锁卵泡，*为来源于健康卵泡
2.2猪健康卵泡和闭锁卵泡的转录组分析
对健康卵泡和闭锁卵泡的基因表达数据分析，共鉴定到1 387个差异基因，包含1 226个上调基因和161个下调基因（图2）。对上调基因进行富集分析，发现参与的生理过程条目有细胞粘附、免疫反应调节、细胞因子调节、细胞响应外部刺激调节等（图3A）。参与的信号通路富集条目有PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路、细胞外基质信号通路等（图3B）。对下调基因进行功能富集分析，发现GO富集条目有固醇代谢、类固醇生物合成过程等（图4A）。KEGG信号通路富集条目有Wnt信号通路和类固醇合成通路（图4B）。
猪健康卵泡和闭锁卵泡差异表达火山图
图2猪健康卵泡和闭锁卵泡差异表达火山图
猪闭锁卵泡上调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
图3猪闭锁卵泡上调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
猪闭锁卵泡下调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
图4猪闭锁卵泡下调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
2.3炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
基于转录组学分析结果，利用qPCR对炎症相关基因表达水平进行探究。发现趋化因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素家族基因表达量在猪闭锁卵泡中显著升高（图5）。
炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
图5炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
3讨论
卵泡闭锁是一个复杂的生物学过程，涉及细胞凋亡和自噬等多种细胞死亡方式。生理情况下，卵泡闭锁是卵巢卵泡优胜略汰的自然现象，可以确保母猪卵泡排出的卵子健康。由于生产中各种因素影响，卵泡闭锁异常增加会导致卵子资源的浪费，影响规模化猪场母猪繁殖效率。
揭示猪卵泡闭锁的机制，有助于开发繁殖调控新技术来提高猪的繁殖潜能。本研究通过高通量测序比较健康和闭锁卵泡转录组变化，筛选了大量差异基因，进一步对差异基因功能分析，发现闭锁卵泡中上调基因大部分集中于免疫、炎症、细胞粘附和细胞因子产生等相关通路。同时发现，趋化因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素家族基因在闭锁卵泡中高表达。研究表明自噬相关基因和凋亡相关基因在闭锁卵泡中的表达量显著上升，在本研究中炎症反应诱导颗粒细胞和卵母细胞的凋亡和自噬，这可能是导致卵泡闭锁的重要原因。因此，养殖生产中需要重点关注环境中易诱发母猪炎症反应的因素，同时采取加强卫生管理、合理调整养殖密度、保证饲料质量等措施，减低母猪炎症反应发生率，避免因母猪卵泡出现异常闭锁，影响母猪繁殖性能。
本研究还发现闭锁卵泡颗粒细胞类固醇合成相关通路活性被显著下调，表明伴随猪卵泡闭锁与类固醇激素合成密切相关。研究表明，雌激素和孕激素的平衡、类固醇合成酶基因的表达变化、激素受体的表达变化以及自噬和凋亡相关基因的表达变化共同调控卵泡的发育和闭锁。孕激素能够促进颗粒细胞凋亡和加快卵泡闭锁退化，这和闭锁卵泡中孕激素水平升高的表型相一致。揭示类固醇激素调控猪卵泡闭锁的机理，可为猪高效繁殖调控技术提供基础。
4结论
本研究通过转录组测序技术全面分析了健康卵泡和闭锁卵泡的基因表达差异，发现抑制炎症反应和提高类固醇激素合成可能是降低猪卵泡闭锁、提高卵泡高效发育的潜在靶点。
目前，虽然对猪闭锁卵泡的形态学特征、发生时期和生化特征已经比较明确，但对于闭锁卵泡基因整体表达情况了解较少。颗粒细胞作为卵泡重要的组成部分，通过合成分泌类固醇激素等在卵泡闭锁中发挥关键作用。利用高通量测序技术全面揭示闭锁卵泡颗粒细胞基因表达，有助于解析卵泡闭锁发生机制。本研究基于卵泡的形态特征，分别收取健康卵泡和闭锁卵泡的颗粒细胞进行转录组测序，对两者差异表达基因参与的生理学过程进行分析，探究母猪卵泡闭锁的机理，并为提高母猪的繁殖力提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验材料
在某屠宰场收集卵巢后，放置于37℃含有1%青霉素-链霉素的PBS缓冲液中送至实验室备用。
1.2健康卵泡和闭锁卵泡的形态学鉴定
根据文献资料及形态学特征鉴定并挑选出健康卵泡和闭锁卵泡用于进一步研究。
1.3猪卵泡颗粒细胞的获取
卵巢达到实验室后，使用生理盐水清洗3遍。随后使用10 mL注射器抽吸卵泡液，卵泡液放置于10 mL无菌离心管中，1 000 rpm离心5 min，去掉上清液，使用M199培养液重悬细胞，重复2～3遍，最后将重悬细胞倒置于10 cm培养皿内，选取片状颗粒细胞，收集到Trizol裂解液中。
1.4 RNA提取及cDNA合成
使用Trizol提取颗粒细胞的总RNA。使用NanoDrop核酸检测仪器测定RNA浓度和纯度，合格样品的OD260/OD280在1.8～2.1。
使用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR反转录试剂盒合成cDNA。置于PCR仪中，50℃15 min→85℃5 s。产物保存-20℃备用。
1.5 qPCR检测
使用Light-Cycler®480 SYBR Green I Master Kit在LightCycler 480仪器上进行基因水平进行检测。获得基因表达cT值后使用2-∆∆CT方法对基因表达水平进行相对定量。
1.6转录组测序分析
使用Trizol提取颗粒细胞的总RNA后加入PolyA和接头后使用Hiseq 4000平台进行文库测序。每组设置3个生物学重复。参考基因组选择Sus_scrofa10.2，序列比对软件选择HISAT2，最终使用featureCounts软件和DESeq2筛选差异表达基因。使用clusterProfiler对差异表达基因进行富集分析。
1.7数据处理和分析
采用2-△△Ct法对定量PCR结果进行分析，数据采用平均值±标准差表示，每个样品的每个基因进行3个重复孔检测。
2结果与分析
2.1猪健康卵泡和闭锁卵泡的鉴定和选择
健康卵泡的卵泡液清亮、表面血管丰富、结构清晰。闭锁卵泡的卵泡液浑浊、表明没有血管分布，结构不清晰（图1A）。进一步观察来源于健康卵泡和闭锁卵泡的卵丘卵母细胞复合体形态和颜色对鉴定结果进行确认。来源于闭锁卵泡的卵丘卵母细胞复合体形态扩散，不紧密，且颜色偏黑（图1B）。
猪健康卵泡和闭锁卵泡
图1猪健康卵泡和闭锁卵泡
A.猪卵巢：▲为闭锁卵泡，*为健康卵泡；B.猪卵丘卵母细胞复合体：▲为源于闭锁卵泡，*为来源于健康卵泡
2.2猪健康卵泡和闭锁卵泡的转录组分析
对健康卵泡和闭锁卵泡的基因表达数据分析，共鉴定到1 387个差异基因，包含1 226个上调基因和161个下调基因（图2）。对上调基因进行富集分析，发现参与的生理过程条目有细胞粘附、免疫反应调节、细胞因子调节、细胞响应外部刺激调节等（图3A）。参与的信号通路富集条目有PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路、细胞外基质信号通路等（图3B）。对下调基因进行功能富集分析，发现GO富集条目有固醇代谢、类固醇生物合成过程等（图4A）。KEGG信号通路富集条目有Wnt信号通路和类固醇合成通路（图4B）。
猪健康卵泡和闭锁卵泡差异表达火山图
图2猪健康卵泡和闭锁卵泡差异表达火山图
猪闭锁卵泡上调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
图3猪闭锁卵泡上调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
猪闭锁卵泡下调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
图4猪闭锁卵泡下调基因GO（A）和KEGG（B）富集分析
2.3炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
基于转录组学分析结果，利用qPCR对炎症相关基因表达水平进行探究。发现趋化因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素家族基因表达量在猪闭锁卵泡中显著升高（图5）。
炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
图5炎症相关基因在猪健康和闭锁卵泡中的表达
3讨论
卵泡闭锁是一个复杂的生物学过程，涉及细胞凋亡和自噬等多种细胞死亡方式。生理情况下，卵泡闭锁是卵巢卵泡优胜略汰的自然现象，可以确保母猪卵泡排出的卵子健康。由于生产中各种因素影响，卵泡闭锁异常增加会导致卵子资源的浪费，影响规模化猪场母猪繁殖效率。
揭示猪卵泡闭锁的机制，有助于开发繁殖调控新技术来提高猪的繁殖潜能。本研究通过高通量测序比较健康和闭锁卵泡转录组变化，筛选了大量差异基因，进一步对差异基因功能分析，发现闭锁卵泡中上调基因大部分集中于免疫、炎症、细胞粘附和细胞因子产生等相关通路。同时发现，趋化因子、肿瘤坏死因子和白细胞介素家族基因在闭锁卵泡中高表达。研究表明自噬相关基因和凋亡相关基因在闭锁卵泡中的表达量显著上升，在本研究中炎症反应诱导颗粒细胞和卵母细胞的凋亡和自噬，这可能是导致卵泡闭锁的重要原因。因此，养殖生产中需要重点关注环境中易诱发母猪炎症反应的因素，同时采取加强卫生管理、合理调整养殖密度、保证饲料质量等措施，减低母猪炎症反应发生率，避免因母猪卵泡出现异常闭锁，影响母猪繁殖性能。
本研究还发现闭锁卵泡颗粒细胞类固醇合成相关通路活性被显著下调，表明伴随猪卵泡闭锁与类固醇激素合成密切相关。研究表明，雌激素和孕激素的平衡、类固醇合成酶基因的表达变化、激素受体的表达变化以及自噬和凋亡相关基因的表达变化共同调控卵泡的发育和闭锁。孕激素能够促进颗粒细胞凋亡和加快卵泡闭锁退化，这和闭锁卵泡中孕激素水平升高的表型相一致。揭示类固醇激素调控猪卵泡闭锁的机理，可为猪高效繁殖调控技术提供基础。
4结论
本研究通过转录组测序技术全面分析了健康卵泡和闭锁卵泡的基因表达差异，发现抑制炎症反应和提高类固醇激素合成可能是降低猪卵泡闭锁、提高卵泡高效发育的潜在靶点。
