后备母猪是指从出生到发情生理阶段的母猪，该阶段母猪对养殖业具有非常重要的作用，其繁殖性能直接关乎养殖场的发展和经济效益。近些年，我国后备母猪面临发情率低、配种率低等问题，高淘汰率和低繁殖性能消耗大量的人力、物力、财力，严重威胁生猪产业的健康发展［1-2］，提高后备母猪的繁殖性能成为目前育种工作者研究的热点。
胰岛素对母猪的繁殖性能有很大影响，日粮能量等能够通过胰岛素经早期生长应答基因－1(Egr-1)、胞外信号调节激酶(EＲK)和神经肽Y(NPY)等途径作用于垂体，提高促性腺激素释放激素(GnＲH)、
促黄体素(LH)和卵泡刺激素(FSH)等的分泌，这些激素作用于卵巢，促进雌激素(E2)和孕激素(P)的合成与释放，进而促进卵泡发育，对母畜的发情、受孕、胚胎发育、仔畜初生质量、断奶质量等繁殖性状具有重要影响［3-4］。研究表明，胰岛素分泌不足而患有糖尿病的后备母猪，其卵泡闭锁率较高［5］。在初情期前，外源胰岛素处理能够减少小母猪的卵泡闭锁率［6］。刘岩等［7］使用不同质量浓度胰岛素刺激猪的颗粒细胞，随着胰岛素质量浓度增加，颗粒细胞的数目及其分泌的雌激素量明显升高，当胰岛素的质量浓度达到10 ng/mL时，颗粒细胞分泌雌激素的质量浓度达到最大。由此可见，胰岛素对于母猪的卵泡发育具有重要作用。
研究证实，铬能够通过提高母猪机体对胰岛素的敏感性影响其繁殖性能，在生产中通过给初产母猪补饲铬调节其繁殖性能，如吡啶羧酸铬［8］、烟酸铬［9］、蛋氨酸铬［10］、皮革蛋白粉［11］等。然而，铬作为重金属元素，会促进血液中部分蛋白质沉淀，引发贫血、肾炎、神经炎、呼吸道炎症等疾病，长期接触甚至诱发肺癌等。因此，寻找其他物质代替铬元素促进母猪胰岛素的分泌是亟需解决的问题。大量研究表明，葡萄糖是参与调控胰岛β细胞合成分泌胰岛素最为重要的调节物质，一方面葡萄糖从转录、转录后以及翻译3个水平促进胰岛素基因的表达量，此外葡萄糖通过第二信使途径等诱导胰岛β细胞分泌胰岛素［12-14］。与铬相比，葡萄糖既安全又易获取，但能否将其作为铬的替代物来调控母猪繁殖性能的研究尚未见报道。为此，本研究通过在饲料中添加葡萄糖诱导母猪胰岛素分泌，检测其血清繁殖相关激素含量的变化，同时通过实时定量PCＲ技术检测其繁殖相关基因表达量的变化，验证葡萄糖对胰岛素的诱导作用以及葡萄糖通过胰岛素对母猪繁殖性状的影响。
1材料和方法
1．1供试动物及样品采集
选取6头70～80 kg大约克后备母猪(河南农科种猪科技有限公司)，每头猪具有同样的遗传背景。将6头猪随机分为2组，其中一组为试验组，饲料中添加200 g/d剂量的葡萄糖［15］，每天3次，促进其体内胰岛素的分泌。另一组作为对照组。所有供试猪严格按照商品猪的饲养规程饲养。饲喂3周后进行屠宰试验，屠宰前停饲24 h。屠宰前抽取每头猪20 mL静脉血，4℃、3 000 r/min离心15 min，分离得到的血清立即冻于液氮中待测激素含量。屠宰后30 min内采集每头猪的子宫组织，样品剪成黄豆大小，立即冻存于液氮中待测其繁殖相关基因表达量。
1．2试剂
葡萄糖以及实时定量PCＲ所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司;胰岛素、雌激素、孕激素酶联免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司;TＲIZOL试剂和PrimeScriptTMＲT－PCＲ试剂盒购自英杰生命技术有限公司;SYBＲPremix Ex TaqⅡ试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
1．3仪器设备
冷冻离心机和PCＲ仪购自艾本德股份公司;紫外分光光度计购自Implen公司;实时定量PCＲ仪购自罗氏公司。
1．4激素水平测定
按照试剂盒说明书使用酶联免疫分析血清中的胰岛素、雌激素和孕酮含量。
1．5总ＲNA的提取及cDNA的合成
使用TＲIZOL试剂提取子宫组织的总ＲNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提ＲNA的质量，然后使用紫外分光光度计检测所提ＲNA的浓度。稀释为同一浓度后，使用PrimeScriptTMＲT－PCＲ试剂盒合成cDNA。
1．6实时定量PCＲ检测繁殖相关基因表达变化
根据GenBank数据库的相关基因信息，使用PrimerPremier 5.0软件设计实时定量分析的引物，包括雌激素受体(estrogen receptor 1，ESＲ)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、视黄醇结合蛋白4(retinolbinding protein 4，ＲBP4)、黄体生成素受体(luteinizinghormone receptor，LHＲ)、孕激素受体(progesteronereceptor，PGＲ)、KISS1受体(KISS1 receptor，GPＲ54)等6个繁殖性状相关的基因，具体引物信息见表1。使用SYBＲPremix Ex TaqⅡ试剂盒进行定量PCＲ分析。扩增体系包含cDNA 2μg，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×SYBＲEx TaqⅡ12．5μL。扩增程序为:94℃3 min;95℃10 s，60℃30 s，40个循环。
定量PCR引物
1．7统计分析
使用SPSS统计分析软件完成激素和基因表达差异的显著性检测，结果用平均值±标准误来表示。
2结果与分析
2．1添加葡萄糖对相关激素的影响
添加葡萄糖极显著改变胰岛素、雌激素和孕酮的表达量(表2)。与对照组相比，试验组胰岛素上调了4.76倍，孕酮表达量变化最大，上调了4.93倍，雌激素上调倍数最低，为1.74倍。
2．2添加葡萄糖对繁殖相关基因表达量的影响
添加葡萄糖对所选的6个繁殖相关基因的表达量均有影响，与对照组相比，仅LHＲ基因表达量下调(试验组和对照组差异不显著)，ESＲ、OPN、GPＲ54、PGＲ和ＲBP4基因表达量均上调。其中，ESＲ表达量变化最大，添加葡萄糖其表达量上调5.056倍(P＜0.01)，ＲBP4基因上调倍数最少，上调2.108倍(P＜0.05)(图1)。图1添加葡萄糖对繁殖相关基因表达量的影响
3结论与讨论
ESＲ基因存在于母猪子宫、阴道等多种靶组织中，对其雌激素发挥作用具有关键作用［16］。ESＲ母猪繁殖周期的维持以及繁殖力的调控起重要作用，是调控母猪产仔数的主效基因［17］。通过PCＲ－ＲFLP分析，ESＲ基因对我国地方品种母猪产仔数均有极显著影响，不同基因型母猪每胎产仔数差异1.40～3.37头，而每胎产活仔数差异0.63～3.58头［18］。本研究中，添加葡萄糖后，后备母猪血清中胰岛素和雌激素含量极显著升高(P＜0．01)，其子宫ESＲ基因表达量也极显著升高(P＜0.01)，提示添加葡萄糖可以通过促进胰岛素的分泌调控后备母猪的繁殖性能。
OPN编码一种细胞外基质蛋白，即骨桥蛋白，是子宫分泌的非常重要的蛋白质。骨桥蛋白能够增强细胞之间的粘合和信号传递，其在胚胎着床、胎盘形成以及维持妊娠方面起着关键作用［19］。猪OPN基因表达量随着妊娠期过程增加，在妊娠期85 d其表达量最高，其表达量与孕激素对猪子宫内膜的调控规律一致，提示其表达量受孕激素的调控［20-21］。研究表明，向大白猪子宫内膜上皮细胞添加不同浓度的雌激素和孕激素，发现雌激素对OPN具有明显的抑制作用，而孕激素明显促进OPN的表达，因为OPN基因上游调控区包含孕激素调控元件(PＲE)［22］。本研究中，在后备母猪饲料中添加葡萄糖后，其雌激素和孕激素表达量均显著上调，但是孕激素的上调幅度(4.90倍)高于雌激素的上调幅度(1.74倍)，所以孕激素对OPN的促进作用比雌激素对OPN的抑制效果更明显，实时定量PCＲ结果与此结果相符，添加葡萄糖后OPN基因表达量极显著增高。
在猪、牛等动物整个发情期子宫内都有LHＲ的表达，其表达量在黄体期最高［23］。研究表明，LHＲmＲNA在济宁青山羊整个发情周期的子宫中都有表达，在发情期表达量最低，在间情期逐渐升到最高值［24］。本研究中，后备母猪饲料中添加葡萄糖对其子宫LHＲ基因表达影响并不显著，可能与选取的子宫组织有关，下一步可检测该基因在卵巢表达量的变化。
基于本研究结果，可以用葡萄糖代替各种铬制剂刺激后备母猪胰岛素上调，促进其繁殖相关激素分泌及基因表达，影响后备母猪的卵泡发育、发情等性状。葡萄糖对动物和人没有直接危害，可以避免铬制剂带来的重金属污染，下一步试验需要精确验葡萄糖对后备母猪繁殖相关基因表达的影响证葡萄糖的添加时间及剂量，将成本降低到最小。
胰岛素对母猪的繁殖性能有很大影响，日粮能量等能够通过胰岛素经早期生长应答基因－1(Egr-1)、胞外信号调节激酶(EＲK)和神经肽Y(NPY)等途径作用于垂体，提高促性腺激素释放激素(GnＲH)、
促黄体素(LH)和卵泡刺激素(FSH)等的分泌，这些激素作用于卵巢，促进雌激素(E2)和孕激素(P)的合成与释放，进而促进卵泡发育，对母畜的发情、受孕、胚胎发育、仔畜初生质量、断奶质量等繁殖性状具有重要影响［3-4］。研究表明，胰岛素分泌不足而患有糖尿病的后备母猪，其卵泡闭锁率较高［5］。在初情期前，外源胰岛素处理能够减少小母猪的卵泡闭锁率［6］。刘岩等［7］使用不同质量浓度胰岛素刺激猪的颗粒细胞，随着胰岛素质量浓度增加，颗粒细胞的数目及其分泌的雌激素量明显升高，当胰岛素的质量浓度达到10 ng/mL时，颗粒细胞分泌雌激素的质量浓度达到最大。由此可见，胰岛素对于母猪的卵泡发育具有重要作用。
研究证实，铬能够通过提高母猪机体对胰岛素的敏感性影响其繁殖性能，在生产中通过给初产母猪补饲铬调节其繁殖性能，如吡啶羧酸铬［8］、烟酸铬［9］、蛋氨酸铬［10］、皮革蛋白粉［11］等。然而，铬作为重金属元素，会促进血液中部分蛋白质沉淀，引发贫血、肾炎、神经炎、呼吸道炎症等疾病，长期接触甚至诱发肺癌等。因此，寻找其他物质代替铬元素促进母猪胰岛素的分泌是亟需解决的问题。大量研究表明，葡萄糖是参与调控胰岛β细胞合成分泌胰岛素最为重要的调节物质，一方面葡萄糖从转录、转录后以及翻译3个水平促进胰岛素基因的表达量，此外葡萄糖通过第二信使途径等诱导胰岛β细胞分泌胰岛素［12-14］。与铬相比，葡萄糖既安全又易获取，但能否将其作为铬的替代物来调控母猪繁殖性能的研究尚未见报道。为此，本研究通过在饲料中添加葡萄糖诱导母猪胰岛素分泌，检测其血清繁殖相关激素含量的变化，同时通过实时定量PCＲ技术检测其繁殖相关基因表达量的变化，验证葡萄糖对胰岛素的诱导作用以及葡萄糖通过胰岛素对母猪繁殖性状的影响。
1材料和方法
1．1供试动物及样品采集
选取6头70～80 kg大约克后备母猪(河南农科种猪科技有限公司)，每头猪具有同样的遗传背景。将6头猪随机分为2组，其中一组为试验组，饲料中添加200 g/d剂量的葡萄糖［15］，每天3次，促进其体内胰岛素的分泌。另一组作为对照组。所有供试猪严格按照商品猪的饲养规程饲养。饲喂3周后进行屠宰试验，屠宰前停饲24 h。屠宰前抽取每头猪20 mL静脉血，4℃、3 000 r/min离心15 min，分离得到的血清立即冻于液氮中待测激素含量。屠宰后30 min内采集每头猪的子宫组织，样品剪成黄豆大小，立即冻存于液氮中待测其繁殖相关基因表达量。
1．2试剂
葡萄糖以及实时定量PCＲ所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司;胰岛素、雌激素、孕激素酶联免疫检测试剂盒购自北京北方生物技术研究所有限公司;TＲIZOL试剂和PrimeScriptTMＲT－PCＲ试剂盒购自英杰生命技术有限公司;SYBＲPremix Ex TaqⅡ试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
1．3仪器设备
冷冻离心机和PCＲ仪购自艾本德股份公司;紫外分光光度计购自Implen公司;实时定量PCＲ仪购自罗氏公司。
1．4激素水平测定
按照试剂盒说明书使用酶联免疫分析血清中的胰岛素、雌激素和孕酮含量。
1．5总ＲNA的提取及cDNA的合成
使用TＲIZOL试剂提取子宫组织的总ＲNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提ＲNA的质量，然后使用紫外分光光度计检测所提ＲNA的浓度。稀释为同一浓度后，使用PrimeScriptTMＲT－PCＲ试剂盒合成cDNA。
1．6实时定量PCＲ检测繁殖相关基因表达变化
根据GenBank数据库的相关基因信息，使用PrimerPremier 5.0软件设计实时定量分析的引物，包括雌激素受体(estrogen receptor 1，ESＲ)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、视黄醇结合蛋白4(retinolbinding protein 4，ＲBP4)、黄体生成素受体(luteinizinghormone receptor，LHＲ)、孕激素受体(progesteronereceptor，PGＲ)、KISS1受体(KISS1 receptor，GPＲ54)等6个繁殖性状相关的基因，具体引物信息见表1。使用SYBＲPremix Ex TaqⅡ试剂盒进行定量PCＲ分析。扩增体系包含cDNA 2μg，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2×SYBＲEx TaqⅡ12．5μL。扩增程序为:94℃3 min;95℃10 s，60℃30 s，40个循环。
定量PCR引物
1．7统计分析
使用SPSS统计分析软件完成激素和基因表达差异的显著性检测，结果用平均值±标准误来表示。
2结果与分析
2．1添加葡萄糖对相关激素的影响
添加葡萄糖极显著改变胰岛素、雌激素和孕酮的表达量(表2)。与对照组相比，试验组胰岛素上调了4.76倍，孕酮表达量变化最大，上调了4.93倍，雌激素上调倍数最低，为1.74倍。
2．2添加葡萄糖对繁殖相关基因表达量的影响
添加葡萄糖对所选的6个繁殖相关基因的表达量均有影响，与对照组相比，仅LHＲ基因表达量下调(试验组和对照组差异不显著)，ESＲ、OPN、GPＲ54、PGＲ和ＲBP4基因表达量均上调。其中，ESＲ表达量变化最大，添加葡萄糖其表达量上调5.056倍(P＜0.01)，ＲBP4基因上调倍数最少，上调2.108倍(P＜0.05)(图1)。图1添加葡萄糖对繁殖相关基因表达量的影响
3结论与讨论
ESＲ基因存在于母猪子宫、阴道等多种靶组织中，对其雌激素发挥作用具有关键作用［16］。ESＲ母猪繁殖周期的维持以及繁殖力的调控起重要作用，是调控母猪产仔数的主效基因［17］。通过PCＲ－ＲFLP分析，ESＲ基因对我国地方品种母猪产仔数均有极显著影响，不同基因型母猪每胎产仔数差异1.40～3.37头，而每胎产活仔数差异0.63～3.58头［18］。本研究中，添加葡萄糖后，后备母猪血清中胰岛素和雌激素含量极显著升高(P＜0．01)，其子宫ESＲ基因表达量也极显著升高(P＜0.01)，提示添加葡萄糖可以通过促进胰岛素的分泌调控后备母猪的繁殖性能。
OPN编码一种细胞外基质蛋白，即骨桥蛋白，是子宫分泌的非常重要的蛋白质。骨桥蛋白能够增强细胞之间的粘合和信号传递，其在胚胎着床、胎盘形成以及维持妊娠方面起着关键作用［19］。猪OPN基因表达量随着妊娠期过程增加，在妊娠期85 d其表达量最高，其表达量与孕激素对猪子宫内膜的调控规律一致，提示其表达量受孕激素的调控［20-21］。研究表明，向大白猪子宫内膜上皮细胞添加不同浓度的雌激素和孕激素，发现雌激素对OPN具有明显的抑制作用，而孕激素明显促进OPN的表达，因为OPN基因上游调控区包含孕激素调控元件(PＲE)［22］。本研究中，在后备母猪饲料中添加葡萄糖后，其雌激素和孕激素表达量均显著上调，但是孕激素的上调幅度(4.90倍)高于雌激素的上调幅度(1.74倍)，所以孕激素对OPN的促进作用比雌激素对OPN的抑制效果更明显，实时定量PCＲ结果与此结果相符，添加葡萄糖后OPN基因表达量极显著增高。
在猪、牛等动物整个发情期子宫内都有LHＲ的表达，其表达量在黄体期最高［23］。研究表明，LHＲmＲNA在济宁青山羊整个发情周期的子宫中都有表达，在发情期表达量最低，在间情期逐渐升到最高值［24］。本研究中，后备母猪饲料中添加葡萄糖对其子宫LHＲ基因表达影响并不显著，可能与选取的子宫组织有关，下一步可检测该基因在卵巢表达量的变化。
基于本研究结果，可以用葡萄糖代替各种铬制剂刺激后备母猪胰岛素上调，促进其繁殖相关激素分泌及基因表达，影响后备母猪的卵泡发育、发情等性状。葡萄糖对动物和人没有直接危害，可以避免铬制剂带来的重金属污染，下一步试验需要精确验葡萄糖对后备母猪繁殖相关基因表达的影响证葡萄糖的添加时间及剂量，将成本降低到最小。
